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酵母質(zhì)粒提取試劑盒說明書
試劑盒采用酶法破碎酵母細胞壁和堿裂解法裂解酵母細胞來提取酵母質(zhì)粒DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細胞壁，提高酵母質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量。吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)及細胞中其他有機化合物。使用本試劑盒提取的酵母質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)的分子生物學(xué)實驗，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗。本試劑盒無需使用酚、氯仿等有毒試劑，操作安全。
操作步驟：
使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標(biāo)簽。溶液YP1在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。
1、取1-5ml酵母培養(yǎng)物（不超過5×107cells），12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。
2、酵母細胞壁的破除：
A、酶法：向酵母菌體中加入470ul山梨醇Buffer，充分懸浮菌體，加入25ul酵母破壁酶和5ul β-巰基乙醇，充分混勻，30℃處理1-2h，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。12000rpm離心1min，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入250ul溶液YP1（請先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。注意：如果菌
塊未*混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。
B、玻璃珠法：向酵母菌體中加入250ul溶液YP1（請先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。加入150-200ul酸洗玻璃珠（自備），漩渦振蕩10min。簡短離心使玻璃珠沉降到離心管底，吸取上清（如上清有所損失，請用溶液YP1補足250ul）于另一干凈離心管中。
3、向離心管中加入250ul溶液YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細菌基因組DNA，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時間不要超過5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。
4、向離心管中加入350ul溶液YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液YP3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5、將上一步所得上清液加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。
9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜*懸空滴加50-200ul經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min。
10、為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。
注意事項：
1、使用前請先檢查溶液YP2和溶液YP3是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。
2、洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50ul，體積過小影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率；DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。
3、質(zhì)粒得率與酵母菌株、質(zhì)?？截悢?shù)、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。通常酵母質(zhì)粒拷貝數(shù)都很低，一般通過電泳或分光光度計法都很難檢測到，可通過PCR或轉(zhuǎn)化大腸桿菌來檢測。
4、DNA濃度及純度檢測：得到的基因組DNA段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)?；厥盏玫降腄NA段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰， OD260值為1相當(dāng)于大約50 μg/ml雙鏈DNA、40 μg/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。
相關(guān)試劑：
R1020 酵母破壁酶溶液
D1900 酵母基因組DNA提取試劑盒
T1060 50×TAE 緩沖液
G8142 GoldView II型核酸染色劑(5000×)
E1020 EB染色液